У флакон із препаратом вводять 2-3 мл стерильної води для ін'єкцій чи ізотонічного розчину натрію хлориду. Суміш у флаконі струшують протягом 30 с (у напрямку поздовжньої осі) до утворення гомогенної суспензії (або суспензії), яку вводять глибоко в/м у верхній зовнішній квадрант сідниці.
Для приготування суспензії використовують стерильну воду для ін'єкцій, ізотонічний розчин хлориду натрію або 0,25–0,5% розчин. новокаїну (5-6 мл), готують ex tempore. Розчинник у флакон вводять повільно зі швидкістю 5 мл за 20-25 с.
Суспензію Біциліну-5 готують асептично, безпосередньо перед застосуванням: у флакон із препаратом під тиском вводять 9 мл стерильної води для ін'єкцій або 0,9% розчину натрію хлориду, або 0,25–0,5% розчину прокаїну. Вміст флакона перемішують до утворення гомогенної суспензії.